Transplantace Langerhansových ostrůvků v IKEM – technika izolace

Klinický program transplantace Langerhansových ostrůvků v IKEM byl zahájen v roce 2005 pod vedením prof. MUDr. Františka Saudka, DrSc. předcházela mu několikaletá experimentální příprava. Ostrůvky se izolují podle tzv. Edmontonského protokolu (Ryan et al., 2005), na jehož vypracování se podílelo 10 světových pracovišť. Tento protokol přísně definuje jednotlivé kroky izolace, použité přístroje i tkáňová média. Výzkumný tým Kliniky diabetologie IKEM vyvinul vlastní prototypy izolačního zařízení a postup upravil podle vlastních pracovních podmínek (Saudek 2003).

Úvod

Diabetes mellitus I. typu je autoimunitní onemocnění způsobené destrukcí β buněk Langerhansových ostrůvků (obr. 1). Ostrůvky tvoří endokrinní složku pankreatu a β buňky produkují nejvýznamnější pankreatický hormon inzulin.

Ostrůvky jsou shluky přibližně 3000 buněk, difúzně roztroušené mezi exokrinní částí pankreatu. Jejich velikost se pohybuje mezi 50–450 μm a v dospělém pankreatu je jich kolem 1 miliónu. Tvoří pouze 1 % pankreatické tkáně a jejich celkový objem nepřesahuje 2 ml. Převážná část ostrůvků je tvořena 4 základními typy buněk – α, β, δ a PP. β buňky se nacházejí v centrální části ostrůvku a tvoří 60–80 % každého z nich. Periferie ostrůvků je složena z buněk α, produkujících hormon glukagon, δ buněk tvořících zejména somatostatin a buněk PP tvořících zejména pankreatický polypeptid. Ostrůvky jsou hustě protkány kapilární sítí a mají vlastní lymfatické zásobení. Malé arterioly vstupují do centra ostrůvků, kde se intenzivně větví do fenestrovaných kapilár, jež se opět spojují do sběrné venuly převážně ještě uvnitř ostrůvků. Hormony pak plynou do jaterního portálního řečiště, kde se přímo podílejí na regulaci metabolických procesů.

Pro transplantační léčbu diabetu je exokrinní část pankreatu nadbytečná a často je zdrojem technických problémů. Proto se několik desetiletí hledal způsob, jak ostrůvky oddělit od 99 % ostatní pankreatické tkáně. Od manuálního vybírání ostrůvků se postupně došlo k poloautomatické metodě založené na enzymatickém rozrušení tkáně pankreatu a separace na základě rozdílné specifické hmotnosti exokrinní a endokrinní tkáně.

Praxe v IKEM

Klinický program transplantace Langerhansových ostrůvků v IKEM byl zahájen v roce 2005 pod vedením prof. MUDr. Františka Saudka, DrSc. Předcházela mu několikaletá experimentální příprava. Ostrůvky se izolují podle tzv. Edmontonského protokolu (Ryan et al., 2005), na jehož vypracování se podílelo 10 světových pracovišť. Výzkumný tým Kliniky diabetologie IKEM vyvinul vlastní prototypy izolačního zařízení a postup upravil podle vlastních pracovních podmínek (Saudek 2003).

K izolaci ostrůvků se používají pankreaty od zemřelých dárců, které splňují daná kriteria a nejsou vhodné k orgánové transplantaci.

Kritéria pro dárce pankreatu: obecná kritéria pro multiorgánový odběr včetně oběhových kritérií, věk 18–65 let, BMI do 40 kg/m2. Kontraindikace: diabetes mellitus, chronický alkoholismus, závažná břišní operace v anamnéze, zhmoždění břicha.

Funkční kapacita ostrůvků je lepší u mladších dárců, ale výtěžnost ostrůvků bývá spíše nižší. Pro výtěžnost ostrůvků jsou nejvhodnější dárci s vyšším BMI. Na zisk a vitalitu ostrůvků má také negativní vliv dlouhodobá hospitalizace dárce a hyperglykémie nad 10 mmol. Studená ischémie odebraného orgánu by neměla přesáhnout 8 hodin.

Postup izolace

Pankreas je dodáván v ledové tříšti se segmentem duodena a kouskem sleziny (obr. 2). Po odpreparování sleziny a duodena se podváže hlavní pankreatický vývod a odstraní maximum tukové tkáně bez porušení pankreatické kapsuly. Dále se v oblasti krčku pankreatu nakanyluje hlavní pankreatický vývod, do nějž se injikuje roztok kolagenázy (obr. 3). Ta vyvolá distenzi acinární tkáně, ale neporuší extraacinárně uložené ostrůvky. Kolagenáza je směsí více než 12 proteolytických enzymů, které po aktivaci rozvolní vazivové součásti orgánu. Po naplnění pankreatu kolagenázou se pankreas dočistí, rozdělí na několik částí a vloží do izolační komory, která je součástí izolační aparatury (obr. 4). Zde dochází k rozvolnění pankreatické tkáně. Jde o uzavřený cirkulační okruh, ve kterém cirkuluje zbylá kolagenáza s malým množstvím ředícího roztoku. Cirkulace je zajišťována pomocí peristaltické pumpy s průtokem 150 ml za minutu. Teplota 37 °C je udržována nepřímým ohřevem ve vodní lázni. Komora je upevněna v třepacím zařízení, kde její jemné kývání společně se skleněnými kuličkami, které se do ní přidávají spolu s pankreatem, mechanicky dopomáhají k rozvolnění pankreatické tkáně. Digesce pankreatické tkáně trvá v závislosti na koncentraci a aktivitě kolagenázy a na kvalitě pankreatu 30–90 minut. Proces rozvolňování se sleduje ve vzorcích cirkulující tekutiny pod mikroskopem. Jakmile se ostrůvky začínají uvolňovat od exokrinní tkáně (zpravidla 50 % volných ostrůvků ve vzorku), zahajuje se sběr rozvolněné tkáně. Odhad správného okamžiku je klíčový pro úspěch celé izolace.

Po uvolnění ostrůvků se otevře cirkulační okruh, zvýší se průtok cirkulující tekutiny a zahájí se systematické ředění celkem asi 10 litry ředícího roztoku (Hanks’ Balanced Salt solution). Vytékající roztok se chladí a sbírá do 500 ml zkumavek. Ty se centrifugují a rozvolněná tkáň se postupně koncentruje, promývá (Medium 199) a uloží do 1 zkumavky s UW roztokem (Viaspan). V průměru se získá 20–50 ml rozložené exokrinní tkáně s volnými ostrůvky (obr. 5).

Dalším krokem izolace je purifikace ostrůvků. Při ní se odstraňuje exokrinní tkáň, vývody a zbylé vazivo od tkáně ostrůvků. Tento krok patří k nejproblematičtějším, dochází při něm k největším ztrátám ostrůvků. Při purifikaci ostrůvků se využívá rozdílné specifické hmotnosti jednotlivých tkáňových struktur, které rozdílně sedimentují v hmotnostním gradientu. Gradient se připravuje z roztoku vysokomolekulárních látek (Biocoll 1.100, 1.077). K purifikaci se používá buněčný separátor COBE 2991 (obr. 6), který je určen pro separaci krevních komponent. Dovoluje rychlé zpracování velkého objemu tkáně, zajišťuje sterilitu, při purifikaci ostrůvků se využívá možnosti postupného vyprazdňování komponent o různé hustotě během centrifugace. Separační vak se naplní médiem s kontinuálně se zvyšující hustotou, čehož se docílí současným plněním dvěma roztoky s rozdílnou hustotou. Tkáň s ostrůvky se dává naposled. Po 5 minutách centrifugace dochází ke kompresi vaku a postupně se odebírá médium o nejnižší hustotě až po nejhustší část. Jednotlivé frakce se sbírají do vychlazených zkumavek, pod mikroskopem se vyberou frakce bez příměsi exokrinní tkáně a spočítá se počet čistých ostrůvků. Ostrůvky se počítají metodou digitální obrazové analýzy (Girman et al., 2008). Tento program umožňuje přepočítat ostrůvky, díky jejich rozdílné velikosti, na tzv. ostrůvkové ekvivalenty odpovídající objemu ostrůvků o velikosti 150 μm. Pro transplantaci je třeba minimálně 300 000 vitálních ostrůvkových ekvivalentů. Vitalita ostrůvků se zjišťuje testováním sekrece inzulinu ostrůvků a fluorescenčním barvením živých a mrtvých buněk (obr. 7).

Ostrůvky se uchovávají ve speciálním předtransplantačním médiu v CO2 inkubátoru při 37 °C a transplantují do 24 hodin od izolace.

Izolace ostrůvků je technicky i časově velmi náročná, trvá 8–10 hodin a vyžaduje spolupráci 4 zaškolených osob. V IKEM zahrnuje izolační tým 10 osob, které se mohou v práci střídat tak, aby z organizačních důvodů nezůstal nevyužit pokud možno ani jeden pankreas. V letech 2005–2008 zde bylo provedeno 24 transplantací ostrůvků ze 107 izolací (viz tab. 1) V letošním roce byly ostrůvky izolovány 29krát a transplantovány k 31. 10. 2009 sedmkrát.

Závěr

Transplantace Langerhansových ostrůvků již představuje reálnou alternativu orgánové transplantace pankreatu. Pro pacienta je sice podstatně méně náročná, ale výsledky stále ještě nejsou takové, jaké bychom si přáli. Především je třeba novými postupy zlepšit výtěžnost samotného izolačního procesu, aby bylo ostrůvků k dispozici více. Dalšími problémy zůstávají nedostatek vhodných dárců a trvalá potřeba imunosupresivní léčby. V současné době se intenzivně studují postupy, jak zlepšit bezprostřední a dlouhodobé přežívání ostrůvků po transplantaci a jak včas diagnostikovat proces odhojování.

Eva Dovolilová, Laboratoř Langerhansových ostrůvků PEM, IKEM, Praha

Literatura:

1. RYAN EA, PATY BW, SENIOR PA, et al. Five-year follow-up after clinical islet transplantation. Diabetes 2005; 54: 2060–2069.

2. SAUDEK F. Léčba diabetu transplantací. Praha: Maxdorf, 2003.

3. GIRMAN P, BERKOVÁ Z, DOVOLILOVÁ E, SAUDEK F. How to use analysis for islet counting. Rev Diabet Stud 2008; 5: 38–46.

Fota autorka a archiv IKEM

 

• tisk
• předplatit si